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重金属镉/铅与喹乙醇抗原合成、单克隆抗体制备及ELISA检测技术研究

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  • 主要完成单位:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
  • 主要完成人员:李建喜,王学智,张景艳,王磊,杨志强,王旭荣,秦哲,张凯,孟嘉仁,孔晓军
  • 起  止  时  间 :2007年1月—2012年12月
  • 获  奖  情  况 :2014年中国农业科学院科学技术成果奖二等奖
  • 内  容  提  要 :
     该项目所属技术领域为免疫学和细胞生物学,特别涉及单克隆抗体在免疫学快速检测技术中的应用。该项目主要研究内容为利用小分子化合物免疫分析技术,开展镉、铅与喹乙醇抗原合成、单克隆抗体制备及ELISA检测技术研究,旨在为重金属镉、铅与喹乙醇的批量筛查和快速检测提供理论支撑和技术支持。
  (1)利用丁二酸酐法,成功合成出喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS),采用IR、TLC、MS、NMR等方法完成了相关表征分析,其分子量为363,熔点为192~196℃。
  (2)分别采用络合剂双位点桥接法和活泼酯化法,建立、优化重金属Cd2+、Pb2+及OLA全抗原的合成方法,合成出免疫、检测抗原共7种。并采用AAS、UV、TNBS等方法完成了7种全抗原的表征分析,其中Cd2+、Pb2+与OLA免疫全抗原的偶联比为55.8、57.1、7.8。
  (3)利用间接ELISA法考察载体蛋白、免疫方法、免疫剂量等条件对抗血清的效价及特异性的影响,确定有效免疫抗原为KLH-IEDTA-Cd、KLH-DTPA-Pb、OLA-HS-BSA,包被抗原为BSA-IEDTA-Cd、BSA-DTPA-Pb、OVA-HS- OLA。按100微克/只的最佳剂量免疫Balb/C小鼠,分别获得抗血清效价为128000(镉,5免)、204800(铅,5免)、16000以上(喹乙醇,4免)的试验用小鼠,并取其脾脏细胞用于细胞融合,融合率可达95%以上。
  (4)采用优化后的细胞融合技术,分别得到3株可稳定传代的阳性杂交瘤细胞株1A1、3H12、1H9,并制备出抗镉、铅及喹乙醇腹水型单克隆抗体,其亚类分别为IgG1、IgG1、IgG2a型,腹水效价分别为2.56×105以上、2.56×105以上、1.6×107;蛋白浓度为15.04毫克/毫升、12.14毫克/毫升、3.24(毫克/毫升纯化后)。
  (5)利用所获得的抗镉、铅及喹乙醇单克隆抗体,建立并优化间接竞争ELISA检测方法,并进行了应用研究,在1.5~128.0微克/升的浓度范围内,Cd2+ 、Pb2+浓度与抑制率有良好的线性关系, IC50分别为11.35微克/升、9.84微克/升。与其他金属元素与抗体无明显交叉反应性;在1~243纳克/毫升的范围内,OLA浓度与抑制率有良好的线性关系,IC50为(9.97±3.50)纳克/毫升,与MQCA、QCA及其他喹喔啉类药物几乎无反应性,通过与HPLC、AAS方法的比较,证明该方法结果可靠,可用于重金属镉、铅及喹乙醇的定量、半定量分析。
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